抗Flag亲和纯化凝胶

产品货号：

SY0431

中文名称：

抗Flag亲和纯化凝胶

英文名称：

Anti-DYKDDDDK(Flag)Affinity Gel

产品规格：

1ml|5ml|25ml

发货周期：

1～3天

产品价格：

询价

本制品由高质量的鼠源IgG2b单克隆抗体与Sepharose 4B gel通过供价偶联制备，本制品具有较高的Flag标签融合蛋白加载容量(至少为1.1mg protein/mL凝胶)，杂蛋白非特异结合少，可用于带有Flag标签的融合蛋白免疫沉淀(IP)和纯化。

抗Flag亲和纯化凝胶可结合Met修饰的N端Flag融合蛋白(Met-FLAG–Protein)，N端Flag融合蛋白(FLAG–Protein)，C端Flag融合蛋白(Protein-FLAG)。

克隆号	1E6
亚型	Mouse IgG2b
纯化方法	Protein A
抗体浓度	7.5g抗体/L凝胶
应用	蛋白纯化，免疫沉淀(IP)
蛋白结合量	≥1.1mg蛋白/mL凝胶
储存缓冲液	10mM Na₃PO₄，150mM NaCl，50%甘油，pH7.4，含有0.02%(w/v)叠氮钠。

组分	1mL	5mL	25mL
抗Flag亲和纯化凝胶	1mL	5mL	25mL
说明书	1份

保存：-20℃，有效期1年。禁止在不含甘油的溶液中冻存！

实验提示

酸性洗脱时，Gly-HCl缓冲液处理时间不要超过20min。
上样缓冲液中不要加入还原剂(如DTT)，还原剂会破坏抗体，如必须要加还原剂，则2×上样缓冲液中还原剂不能超过10%或100mM。
上样缓冲液中SDS会破坏抗体，所以抗Flag亲和纯化凝胶不能重复使用。
纯化推荐将凝胶装入层析柱中，所有溶液可以直接流过。若在管中，需反复离心除去溶液，操作繁琐。
除样本和裂解液外，其它溶液建议3倍体积，重复3次。可在保证纯化效果基础上适当缩减重复次数。
建议同时做阳性与阴性对照组。

一、制备细胞裂解液(以哺乳动物细胞为例)
注意：样品中不能含有颗粒不溶物，可以用0.22μm滤膜过滤或10000×g离心15min；如有必要，可以加入蛋白酶抑制剂；如样品太粘稠，可以加入核酸酶处理。
细胞密度70～90%，100mm培养皿(约10⁶～10⁷细胞)，加入1mL裂解液(50mM Tris-HCl，pH7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，1%Triton X-100)。推荐加入蛋白酶抑制剂Cocktail(货号：SY0323)。

清洗细胞
- 贴壁细胞：去除生长培养基，用PBS洗2次，去除PBS，加入裂解液(10⁶～10⁷ cells/mL)。
- 悬浮细胞：细胞转移到离心管中，420×g离心5min，去除上清。用PBS重悬，420×g离心5min，重复1次，去除上清，加入裂解液重悬(10⁶～10⁷ cells/mL)。
加入裂解液后，孵育15～30min。
离心，12000×g，10min。
注：贴壁细胞离心前先把细胞刮下来。
收集上清到预冷的样品管中。上清可储存在-70℃。

二、应用
可以使用层析柱或免疫沉淀(IP)纯化目的蛋白。1～3mL凝胶层析柱可以纯化约100mL细胞裂解液；如样品体积较小(1～2mL细胞裂解液)，可以使用免疫沉淀(IP)法；如需处理较大体积细胞裂解液，推荐使用溶液体系。

层析柱法
- 装柱
  - 准备层析空柱(货号：SY0404～SY0408)；用2～3倍柱体积的TBS(50mM Tris-HCl，pH7.4，150mM NaCl)或其他适合缓冲液洗柱2次。
  - 颠倒混匀抗Flag亲和纯化凝胶，保证凝胶均一。取1～3mL凝胶装柱(纯化约100mL细胞裂解液)。
  - 用2～3倍柱体积的TBS洗2次，待液体流尽后，用3倍体积的0.1M Gly-HCl，pH3.5冲洗，要保证凝胶平面平整。Gly-HCl缓冲液处理时间不要超过20min。
  - 用5倍体积TBS平衡凝胶柱，直至流出液达到中性pH。
- 纯化
  - 上样：在层析柱中加满蛋白裂解液，重复上样2～3次可以尽可能增加蛋白与凝胶结合量。
  - 清洗：用10～20倍柱体积的TBS清洗，以去除非特异结合的蛋白。
  - 洗脱(可选以下2种方法之一)：
    - 酸洗脱：收集管中加入15～25μL 1M Tris，pH8.0，分别用1mL 0.1M Gly-HCl，pH3.5洗脱，再重复5次。
    - 3×Flag多肽(货号：SY0421)洗脱：用TBS配制Flag多肽溶液(100μg/mL)洗脱，分别用1倍柱体积多肽溶液洗脱，重复4次。
- 填料再生与保存
  - 柱再生：使用后立即再生，用3倍柱体积0.1M Gly-HCl，pH3.5清洗，立即用TBS平衡，直至达到中性pH.
  - 保存：用10倍柱体积TBS(含50%甘油，0.02%叠氮钠)清洗，再加入5mL该溶液至柱中，保存在2～8℃或-20℃中。
免疫沉淀(IP)
- 免疫沉淀(IP)
  - 充分重悬抗Flag亲和纯化凝胶，尽量形成均一的溶液。取40μL混合液(20μL gel)至新的离心管中。
  - 5000～8200×g离心30 s，使凝胶沉淀在离心管底部，在加入样品前，静置1～2min。去除上清，此时要小心操作，避免吸到凝胶。
  - 加入500μL TBS，轻轻的重悬Anti-Flag Affinity Gel，10000rpm离心30 s，弃上清，重复上述步骤1次。
  - 可选步骤。为去除凝胶中痕量的未结合抗体，可加入500μL 0.1M glycine HCl，pH3.5清洗凝胶，离心去除上清，加入3倍体积TBS，轻摇2～3分钟，5000～8200×g离心30 s，弃上清，重复洗涤至上清pH为中性。Glycine HCl处理时间切勿超过20min。
  - 加入200～1000μL细胞裂解液，如有必要，可用裂解液调整至终体积1mL。细胞裂解液的体积取决于Flag融合蛋白的表达量。阳性对照，需要加入1mL TBS和4μL 50ng/μL Flag-BAP融合蛋白(约200ng)；阴性对照，只要加入1mL裂解缓冲液即可(不含蛋白)。
  - 4℃缓慢孵育2小时。如需提高结合效率，可延长至过夜。
  - 5000～8200×g离心30 s，去除上清。
  - 上述沉淀用0.5mL TBS，轻摇混匀，5000～8200×g离心30 s去尽上清，重复3次。
- Flag融合蛋白洗脱(可选以下3种方法之一)
  - 非变性洗脱(3×Flag多肽)
    - 配制3×Flag多肽洗脱液：用0.5M Tris-HCl溶液，pH7.5(含1M NaCl)溶解3×Flag多肽，终浓度为25μg/μL。用ddH2O稀释至5μg/μL，加入3μL 5μg/μL的3×Flag多肽，加入到100μL TBS中(终浓度150ng/μL)。
    - 分别加入100μL 3×Flag多肽洗脱液，4℃孵育30min(慢慢摇晃)，5000～8200×g离心30 s，转移上清至新管中(不要吸到凝胶)。如立即使用，上清可保存在4℃，-20℃长期保存。
  - 酸性洗脱(0.1M Gly-HCl，pH3.5)
    加入100μL 0.1M Gly-HCl，pH3.5，室温孵育5min(慢慢摇晃)，5000～8200×g离心30 s，转移上清至新管中(含10μL 0.5M Tris-HCl，pH7.5，1.5M NaCl)。注意不要吸到凝胶。如立即使用，上清可保存在4℃，-20℃长期保存。
  - 用SDS-PAGE上样缓冲液洗脱
    加入20μL 2×上样缓冲液(125mM Tris-HCl，pH6.8，4% SDS，20%甘油，0.004%溴酚蓝)，煮沸3min，5000～8200×g离心30 s。上清可直接SDS-PAGE电泳，或WB检测。
- 填料再生与保存
  - 再生：使用后立即再生，加入3倍凝胶体积0.1M Gly-HCl，pH3.5，轻摇3～5min，5000～8200×g离心30 s，弃上清。立即用TBS平衡：加入3倍体积TBS，轻摇2～3min，5000～8200×g离心30 s，收集上清测定pH，如为中性(原TBS加入前pH)，则进行下一步，如仍为酸性，则重复平衡步骤。
  - 保存：用10倍凝胶体积TBS(含50%甘油，0.02%叠氮钠)清洗，再加入适量该保存溶液至填料中，保存在2～8℃或-20℃中。保存缓冲液添加量，恢复至纯化前即可，体积比胶:缓冲液=1:1，可以增大缓冲液体积，缓冲液主要是提供必要的pH值和避免-20℃结冰。
溶液体系
- 调整蛋白裂解液pH至pH7～8，含有0.15M盐离子，如NaCl，可以降低非特异性蛋白结合。需去除Flag融合蛋白裂解液中的不溶成分。
- 重悬抗Flag亲和纯化凝胶，转移至新离心管中。3倍体积TBS，轻摇2～3min，5000～8200×g离心30 s，弃上清，重复洗涤至上清pH为中性。
- Flag融合蛋白裂解液与抗Flag亲和纯化凝胶孵育1h，在孵育过程中轻摇，以保证蛋白与凝胶充分接触。可根据情况，调整孵育时间。
- 1000×g离心5min收集凝胶-Flag融合蛋白；
- 用10～20倍柱体积的TBS清洗凝胶，以去除非特异蛋白。
- 洗脱Flag融合蛋白【参照上述洗脱步骤】。
- 填料再生和保存【参照上述步骤】。

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